[GY22126]PKH26红色荧光细胞链接试剂盒 [ PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit ]

货号:GY22126-1mL

规格:1mL

价格:¥4000元

货号:GY22126,室温保存

产品说明

PKH26荧光细胞连接试剂盒采用拥有专利的膜标记技术,专利膜标记技术,稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光,染色方式依赖于细胞与膜的类型,主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示示踪研究。

试剂组成

PKH26染料*1×10-3M (溶于乙醇)

稀释液C

1×0.1mL

1×10mL

1×0.5mL

60mL

1mL

120mL 


所需设备和试剂(试剂盒未提供)

·充分分散的单个悬浮细胞

·含血清的组织培养基(完全培养基)

·无Ca2+,Mg2+和血清的培养基或者缓冲盐(如Dulbecco’s PBS或Hank’s BSS)

·血清,白蛋白或其它组织兼容性蛋白

·离心管(4-15mL)

·温控离心机(1,000×g)

·荧光分析设备(荧光读板机,荧光或共聚焦显微镜,流式细胞仪)

·层流罩

·血球计数板或细胞计数器

·载玻片和盖玻片

注意事项和免责说明

该产品仅用于科研,不用于制药、家庭或其它用途。请遵照安全数据清单中关于有害及安全操作规范操作。

储存/稳定性

PKH26乙醇溶液冷藏保存。保证染料乙醇溶液瓶盖盖紧减少蒸发以防止染料浓度升高。该染料避光保存,使用前观察是否有结晶。如出现结晶,室温防止30min,然后超声或震荡直至溶解。

稀释液C可室温或冷藏保存。如果冷藏保存,使用前复温至室温。稀释液C为无菌溶液,不含任何防腐剂和抗生素,其需保持无菌。不要将染料储存于稀释液C中。溶于稀释液C的工作液需现配现用,且配好后需立即使用。

 

一般细胞膜标记操作过程

 

亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。染色强度是染料浓度和细胞浓度的函数,与渗透性无关。因此,保证染料添加量不过量非常关键。过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失或降低细胞活性。

 

下列过程可用于体内体外细胞的标记,包括干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞或者任何其他细胞。体内细胞的标记过程需一定的改进,如血小板的染色,或者选择性标记吞噬细胞。

 

下述染色过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。该浓度被证明适用于多种细胞。使用者需通过评估染色后细胞活率(如,PI染色)、荧光强度、染色均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等,根据实验目的,确定最优的染料浓度和细胞浓度。

 

注意1:PKH26染色过程中,不能存在叠氮化物或代谢毒性物。

注意2:虽然贴壁细胞也可以染色,但单个悬浮细胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶(trypsin/EDTA)将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染色效果更佳。

 

下列过程最终体积为2mL,PKH26浓度为2×10-6M,细胞浓度为1×107cells/mL。

 

以下过程均在室温下进行(20-25℃)

 

1. 将2×107个细胞于离心管中,用不含血清

  培养基洗一遍。

注意:血清蛋白和脂质会与染料结合,降低与细胞膜结合的染料浓度。最好在用稀释液C重悬细胞染色前(第四步)用无血清培养基或缓冲液洗细胞一次(第一步)。

 

2. 400×g离心5分钟。

注意:PKH26染料不能直接加到离心沉淀中,这样会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。

 

3. 离心后,小心吸弃上层清液,剩余上层细  胞液体积不超过25μL。

注意:为得到可重复的实验结果,在用稀释液C重悬时,减少残留培养基或缓冲液体积非常重要。见参考文献9的注意28。

 

4. 加入1mL稀释液C用移液管轻轻吹打混匀,制备  2×细胞悬液。不要用振荡器震荡,不要让  细胞在稀释液C中保存太长时间。

注意:生理盐(physiologic salts)的存在会使得染料结团并大幅降低染色效率。因此,需确保染色时细胞悬浮于稀释液C中,不含培养基或缓冲盐。

 

5. 临染色之前,将4μL PKH26乙醇溶液加  入1mL稀释液C中,充分混匀,配制的  2×染色液(4×10-6M)。

注意1:为减少乙醇对细胞活率的影响,步骤5加入的染料使得步骤6中乙醇最终浓度不能超过1-2%。

注意2:如果所需染料最终浓度<2×10-6M,需用100%乙醇将PKH26稀释于另一单独的容器中,以确保实验结果的可重复性。

 

6. 快速将1mL 2×细胞悬液(步骤4)加入  1mL 2×染色液(步骤5)中,立即用移液  管混匀。最终细胞浓度为1×107/mL,

  PKH26浓度为2×10-6M。

注意:由于染色瞬间完成,快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果非常重要。下列措施有助于得到较优的结果:

  a.不要将PKH26染料直接加入含2×细胞的稀释液C中。

  b. 将2×细胞悬液(步骤4)与2×染色液(步骤5)等体积混合。

  c. 调整2×细胞和2×染料的浓度避免染色  体积太小(<100μL)或太大(>5mL)。

  d. 用电动移液器快速将细胞和染料混匀。  血清移液管混匀速度太慢而使得染色不  均匀。Racking和旋涡震荡混匀同样混匀  较慢,染色均一性较差。

  e. 分配体积尽量准确,以保证样品与样品  之间,实验与实验之间的可重复性。

 

7. 混匀后的染色的细胞孵育1-5 min。由于  染色速度较快,延长孵育时间对实验没有帮助。

注意:让细胞在染色液中停留尽量短的时间,同时保证得到理想的染色强度。因为稀释液C缺少生理性盐,过长时间的暴露在稀释液C中会造成某些细胞活力降低。如果不能确定其影响程度,可增加仅作稀释的对照组和只用乙醇而不用染料染色的对照组。

 

8. 加入等体积的血清(2mL)或其它合适的蛋白溶液(如1% BSA)终止反应,孵育1min以结合多余的染料。

注意1:血清(或等效的蛋白浓度)为最优的终止液。如果用完全培养基替代,添加体积为10mL。

注意2:不要通过加稀释液C或离心来终止反应。

注意3:不要用无血清培养基或缓冲盐,他们会使染料产生聚集。染料聚集使清洗过程中无法洗净,使得分析过程中仍存在未标记的细胞。

 

9. 将细胞在20-25℃条件下400×g离心10min,小心吸弃上清。用10mL完全培养基重悬,将重悬液转移至另一新的无菌离  心管中,20-25℃条件下400×g离心5 min。用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没  结合的染料。

注意1:将重悬液转移至新离心管中,减少了离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响;

注意2:不要用稀释液C清洗。

 

10. 最后一步清洗后,用10mL完全培养基重悬细胞评估细胞回收率,细胞活率和荧 光强度(图2。离心重悬细胞至所需活细  胞浓度。

注意1:染色后的细胞可以用中性甲醛固定,避光条件下,荧光强度至少3周内保持稳定。

注意2:染色荧光强度一般为背景的100-1000倍。虽然染色的CV值与细胞种类有关,但荧光分布应该尽量均匀对称。

 

图2. PKH26染色优化

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MC-38 TIL细胞用上述指定PKH26浓度染色,最终细胞浓度为1×107/ml。活力(▲)由FITC染色测定,平均荧光强度(●)用流式细胞仪检测。用20μM PKH26标记后,抗肿瘤TIL特异性和效能没有改变。